Структурно-аналитическое исследование церулоплазмина белых крыс
Диссертация
Автор: Захарова, Елена Тихоновна
Название: Структурно-аналитическое исследование церулоплазмина белых крыс
Справка: Захарова, Елена Тихоновна. Структурно-аналитическое исследование церулоплазмина белых крыс : диссертация кандидата биологических наук : 03.00.04 Ленинград, 1984 188 c. : 61 85-3/1626
Объем: 188 стр.
Информация: Ленинград, 1984
Содержание:
ОБЗОР ЖТЕРАТУРЫ
ГЛАВА I ГЕНЕТИЧЕСКИ ОБУСЛОВЛЕННЫЕ НАРУШЕНИЯ ОБМЕНА • МЕДИ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ
1 1 Биологическая роль меди,имедьсодержащие белки
12 Нарушения обмена меди
13 ОткрытиеЦП,егораспространение в животном мире
ГЛАВА
II ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЦП ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ
2 Молекулярная масса и другие физико-химичест кие параметры ЦП
22 Каталитическая /оксидазная/ активность ЦП
23 Влияниеи онОБ на каталитическую активность ЦП
24 Структурная организация молекулы ЦП человека: сднодепочечная структура и доменное строение
25•Генетический полиморфизм Структурныеварианты ЦП
26 Молекулярная гетерогенность ЦП
261 Углеводы в составе молекулы ЦП
27 Аминокислотный состав ЦП
28 Типы ионовмеди,медьсвязывающиесайтыЭво- люция ЦП
2 9 Иммунологический анализ ЦП
ГЛАВА
III БЙОЛОШЧЕСКИЕ ФУНКЦИЙ ЦП
5 Ферроксидазная активность ЦП (КФ11631)
32 Медьтранспортная функция ЦП -
33 Антиоксидантные свойства ЦП
34 Регуляция уровня биогенных аминов
35 Роль ЦП Б гомеостазе меди
3 6 Поли функциональность ЦП
ГЛАВА 1У ОШЕН ЦП В НОРМЕ И ПАТОЛОГИЙ
4 Биосинтез,регуляция и катаболизм ЦП
42 Молекулярная организация гена ЦП крысы
43 Последовательность реакций котрансляционного созревания ЦП крысы
44 Дефект синтеза,созревания и структуры ЦП при ГЛД ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА У МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
5 Выделение ЦП крысы и человека
52 Седиментационный анализ ЦП
53 Электрофоретический анализ ЦП
54 Определение оксидазной активности ЦП
55 Получение апо-ЦП
56 Получениеспецифических антител к ЦП крысы и человека
57 Иммунодиффузия
5 Иммуноэлектрофорез
59 Восстановление и карбоксиметилирование ЦП
510 Пептидные карты ЦП крысы и человека
5 1 Получение йодированныхпроизводных белков и их фрагментов
512 Тонкослойныепептидные карты йодированных белков
513 Аминокислотный анализ белков
514 Определение N-концевых аминокислотных остатков
515 Определение содержания триптофана и тирозина -
516 Определение свободных сульфгидрильных групп
517 Определение углеводного состава
518 Определение содержания меди
519 Определение содержания белка
520 Выделение фракции аппарата Гольджииз1шеток печени крысы
521 Иммунологический анализ ЦП из аппарата Гольджи
522 Анализ ЦП методом ЭПР-спектроскопии
ГЛАВА У ВЫДЕЛЕНИЕ И ШЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЦЕРУЛОПЛАЗМИНА КРЫСЫ
6 1 Выделение и очистка ЦП крысы
62 Определениеудельной оксидазной активностиЦП крысы
63 Определение молекулярной массы ЦП крысы вЛ Идентификация апо-формы белка в препаратах ЦП крысы
65 Химический состав ЦП крысы
66 Сравнительный анализ ЦП крысы, и ЦПчеловека методом пептидных карт на бумаге
67 Исследование ЦП крысы и ЦП человека и фрагментов этих белков методом тонкослойныхпептидных карт йодированных гидролизатов
68 Каталитически активная формаЦП изаппаратаГольджи печеночных клеток крысы
69 Ферментативные свойства ЦП крысы
610 ймыунохимический анализ ЦП крысы, ЦП человека и ЦП крысы из аппарата Гольджи ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Ж
ВЫВОДЫ 6
СПИСОК ЖТЕРАТУРЫ - в
Введение:
Актуальность проблемы. В Лаборатории биохимической генетики НИИЭМ АМН СССР под руководством члена-корреспондента АМН СССР профессора А.Нейфаха проводятся всесторонние исследования молекулярных механизмов развития тяжелого наследственного заболевания человека - болезни Вильсона-Коновалова или гепатолентикулярной дегенерации (ГЛД). Это заболевание характеризуется моногенным наследованием и ярко выраженными нарушениями обмена меди, в результате чего соли меди в токсических количествах откладываются в различных органах больных, в том числе в печени и тканях головного мозга. Нарушения обмена меди непосредственно связаны с дефицитом медьсодержащего гликопротеида плазмы крови - церулоплазмина (ЦП), белка, ответственного за межорганный транспорт меди.Исследования, проводимые в Лаборатории биохимической генетики НИИЭМ, с убедительностью показывают, что в печени больных ГЛД нарушены пути биосинтеза и созревания ЦП /8,14,36/. Кроме того, продемонстрировано, что в плазме некоторых больных циркулирует ЦП с измененной структурой /28,29/.Весьма вероятно, что все эти изменения обусловливают д е р цит ЦП в крови больных ГЛД, следствием чего является отложение солей меди в токсических концентрациях в клетках внутренних органов и это в свою очередь служит причиной развития симптомов заболевания.Детальное исследование всех закономерностей биосинтеза и созревания ЦП в норме и при патологии требует, чтобы непосредственно изучалась та живая ткань, которая синтезирует этот белок, то есть ткань печени. Но живая ткань печени человека может быть - 7 получена для исследования только при особых обстоятельствах и притом в очень ограниченных количествах путем биопсии. Все это крайне осложняет возможности исследования на здоровых и больных людях. В связи с этим анализ закономерностей биосинтеза и созревания ЦП наиболее целесообразно производить на модельных системах, то есть на животных. Такой модельной системой может служить ткань и культура клеток печени крысы. При использовании этой модельной системы уже получена ценная информация о природе мРНК, кодирующей ЦП /16/, о молекулярной организации гена ЦП /15,45/, о путях биосинтеза, внутриклеточной миграции, котрансляционных и посттрансляционных модификациях и секреции ЦП крысы /31,5V» Изучение закономерностей биосинтеза ЦП в модельной системе прежде всего требует детальной физико-химической и структурной характеристики данного белка и выяснения общности строения церулоплазминов крысы и человека, так как конечной целью проводимых исследований является изучение молекулярной патологии ЦП человека и разработка рациональных способов диагностики и лечения бо^ лезни ВильсонаЧСоновалова у человека.Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования было дать всестороннюю характеристику физико-химических свойств ЦП крысы. Исходя из поставленной цели основными задачами исследования являлись: I / получение очищенных препаратов ЦП крысы; 2/ доказательство гомогенности получаемых препаратов ЦП; 3/ определение основных физико-химических параметров и элементов структурной организации ЦП крысы; 4/ сравнительный анализ свойств и строения ЦП крысы и человека; 5/ получение специфических антител к ЦП крысы, которые могли бы - 8 быть использованы в дальнейших исследованиях по биосинтезу и обменным превращениям этого белка.Научная новизна работы. Ранее в Лаборатории биохимической генетики НШЭМ уже предпринималась попытка изучения свойств ЦП крысы / 2 / . В этой работе были охарактеризованы основные параметры белка, но, в целом, работа носила предварительный характер. В то время как рзико-химические свойства ЦП человека достаточно хорошо охарактеризованы, и имеется обширная литература по этому вопросу, ЦП крысы до сих пор изучен явно недостаточно. В литературе опубликовано всего несколько единичных работ, посвященных этому белку, результаты которых к тому же носят противоречивый характер /83,123,132/. Таким образом, дальнейшее исследование и уточнение закономерностей строения и анализ свойств ЦП крысы представляется актуальным.Научно-практическое значение полученных результатов. Получение гомогенных препаратов ЦП крысы и моноспецифических антител к ним явились основой для работ по выделению ЦП-мРНК и изучению механизмов созревания ЦП в гепатоцитах, проводимых в Лаборатории биохимической генетики НШЭМ АМН СССР. Полученные результаты по сравнительному исследованию ЦП позволяют определить особенности строения и свойств ЦП крысы и показывают, что ЦП - синтезирующая система печени крысы может служить адекватной моделью для изучения биосинтеза и обмена ЦП человека, выяснение которых необходимо для расширения наших знаний о молекулярных механизмах развития ГЛД. Структура диссертации: Работа изложена на 1S6 страницах машинописного текста, содержит 37 рисунков, I I таблиц. Диссертация состоит из введения, - 9 обзора литературы (главы 1-1У), материалов и методов исследования (глава У), собственных исследований (глава У1), обсуждения результатов и выводов. Список литературы содержит 214 названий работ на русском и иностранных языках.Положения, которые выносятся на защиту: 1. В диссертации разработаны оптимальные условия для препаративного получения ЦП крысы.2. Изучены физико-химические свойства ЦП крысы и определены критерии гомогенности препаратов белка.3. В результате сравнительных исследований церулоплазминов крысы и человека в основном продемонстрировано сходство ряда физикохимических параметров, а также доменной структуры этих белков.4 . Предложен оригинальный способ иммунизации кроликов препаратами ЦП крысы.5. Получены моноспецифические антисыворотки против ЦП крысы с высоким титром.Апробация диссертации: Апробация диссертации состоялась на научной конференции Лаборатории биохимической генетики НЙЙЭМ АМН СССР 23/XI-84 г.Список работ, опубликованных по материалам диссертации: 1. Выделение и физико-химическая характеристика церулоплазмина плазмы крови белых крыс.Захарова Е.Т., Васильев В.Б., Горбунова В.П., Шавловский М.М., Биохимия, 1983, 48, 10, I709-I720.2. Анализ видовых различий радиоактивно меченных церулоплазмина и альбумина с помощью пептидных карт. Васильев В.Б., Захарова Е.Т., Шавловский М.М., Вопросы медицинской химии, 1983, 3, 29, 70-74. _ 10 3. Исследование первичной структуры церулоплазмина, Борисова О.П., Васильев В.В., Вахарловский В.Г., Захарова Е.Т., Шавловский М. М., 1У Всесоюзный биох.съезд, Ленинград, Наука, 1979, с.45.4 . Структурная организация церулоплазмина. Борисова 0;П., Вагин А.А., Васильев В.Б., Горбунова В.Н., Зайцев В.Н., Захарова Е. Т., Маслов В.Г., Мошков К.А., Яковлев А . С , Нейфах А.,Шавловский М.М., У1 конференция биохимиков прибалтийских республик, БССР и Ленинграда, Рига, I98I, с.240-241.6. Моделирование молекулярной патологии гепатолентикулярной дегенерации. Борисова О.П., Васильев В.Б., Захарова Е.Т., Шавловский М.М., I Всесоюзный съезд мед. генетиков, Киев, 1984, 53-54.ОБЗОР ЖТЕРАТУРЫ
|
